Виробництво генно-інженерного інсуліну людини. Оптимізація умов ферментативного гідролізу при виробництві
Мал. 4. ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ продуктів спільного гідролізу ГБ залежно від температури: I - інсулін; II - ПП; 1 - гідроліз при 13°; 2 - гідроліз при 24°; 3 - гідроліз при 30°
Схожа картина була отримана при визначенні впливу рН на синтез ПП: кількість ПП збільшувалося при збільшенні рН.
Отримані залежності нелінійні й при проведенні експериментів при низьких температурах (1-6°) і значенні рН у районі 7,1 ± 0,1 було з'ясовано, що результати гідролізу практично не змінюються, однак зміст ПП усе ще великий (до 2-5%).
Експериментальним шляхом були знайдені оптимальні умови спільного гідролізу: рН = = 7,1 ±0,1 nt = 6± 1°.
Визначення оптимальної концентрації ферментів для одностадійного гідролізу ГБ
У результаті проведених експериментів було з'ясовано, що співвідношення ГБ : фермент впливає тільки на час гідролізу, але не на якість одержуваного продукту. Таким чином, головним при пошуку оптимальних концентрацій ферментів було визначення оптимального співвідношення трипсин : карбоксипептидаза В.
При проведенні трипсинолізу було помічено, що якщо вчасно не зупинити реакцію, то концентрація ДАІ починає зменшуватися, а ПП - збільшуватися. У результаті було зроблено припущення про те, що ПП - продукт побічного впливу трипсину на ДАІ. Зменшення такого впливу при проведенні спільного гідролізу можливо тільки при збільшенні кількості карбоксипептидази В, що трансформує ДАІ в інсулін.У результаті проведених експериментів висунуте припущення було підтверджено й показанО, що при співвідношенні (по масі) карбоксипептидаза В : трипсин > 1,6:1 ПП у гидролизаті практично відсутній (мал. 5).
Мал. 5. ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ продуктів спільного гідролізу ГБ при рН 7,0,14° і співвідношенні карбоксипептидаза В:трипсин = 2:1
Отриманий у результаті гідролізу первинний інсулін містив незначну кількість ПП, що легко видалялася при іонообменій хроматографії (наприклад, з використанням носіїв на основі сефарози).
У результаті проведеної експериментальної роботи були визначені оптимальні фізико-хімічні умови проведення спільного гідролізу ГБ: температура реакційного середовища < 6°; рН = 7,1 ±0,1; співвідношення карбоксипептидаза В : трипсин > 1,6:1.
При проведенні подальших досліджень білок ПП був виділений у чистому виді й ідентифікований методом мас-спектрометрії як дезтреонінінсулін.
На основі отриманих даних виробництво ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ на ВАТ «Національні біотехнології» перейшло на більш технологічну схему одержання первинного інсуліну з ГБ методом спільного гідролізу. Ця схема містить у собі два етапи: гідроліз і хроматографічне очищення інсуліну на SP-Sepharose FF.
Оптимальні умови проведення спільного гідролізу ГБ у промислових умовах наступні: рН = 7,1 ±0,l,t = 5± 1° і співвідношення (по масі) ГБ: карбоксипептидаза В : трипсин = 2000:1,6:1. Тривалість процесу гідролізу становить 15 ± 1 ч.
Нова технологічна схема процесу дозволила знизити собівартість первинного інсуліну в 2,5 рази й збільшити потужність виробничої лінії з 10 до 30 кг субстанції ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ в рік.
Використана література:
Теоретический и научно-практический журнал «Биотехнология» Москва, 2006.
№ 4, С56-63.