Виробництво генно-інженерного інсуліну людини. Оптимізація умов ферментативного гідролізу при виробництві

Кит Аланін Серин Треонін Аланін

Із цього слідує, що дана ділянка, швидше за все, не має вирішального значення для біологічної активності інсуліну.

Деякі структури молекули інсуліну мають високу консервативність. У їхньому числі положення трьох дисульфідних містків, гідрофобні залишки в С-кінцевій ділянці В-ланцюга й С- і N-кінцеві ділянки А-ланцюга.

Використання хімічних модифікацій і замін окремих амінокислотних залишків у цих ділянках допомогли ідентифікувати структуру активного центра інсуліну. Розташована на С-кінці В-ланцюга гідрофобна ділянка бере участь також у димеризації інсуліну.

Цинк, концентрація якого в β-клетках острівців Лангерганса досягає високих значень, формує комплекси з інсуліном. Інсуліни всіх хребетних утворюють димери за допомогою водневих зв'язків між пептидними групами залишків В24 і В26 двох мономерів, які при високих концентраціях гормону, у свою чергу, реорганізуються в гексамери, що містять по два атома цинку в кожному. Наявність таких высоковпорядкованих комплексів істотно полегшило вивчення кристалічної структури інсуліну. При фізіологічних концентраціях інсулін перебуває в мономерній формі.

Одержання генно-інженерного інсуліну людини.

В 1980 р. американськими вченими Міллером і Бакстером був уперше описаний процес клонування людського гена в Е. coli з наступною індукцією й одержанням білка, ідентичного людському . Цим білком був інсулін людини.

У промислових умовах рекомбінантний інсулін уперше отриманий американською фармацевтичною компанією Eli Lilly разом з біотехнологічною компанією Genentech (США). Перший ГЕННО-ІНЖЕНЕРНИЙ ІНСУЛІН ЛЮДИНИ надійшов на фармацевтичний ринок в 1982 р.У цей же час компанія «Novo-Nordisk» (Данія) розробила технологію одержання ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ, засновану на використанні генетично модифікованих дріжджових культур у ролі суперпродуцентів інсуліну людини. Використання еукаріот, що мають подібну з людською систему процессінгу білків, у ролі продуцентів інсуліну дозволило одержати гормон або його попередника в нативній формі. Значною перевагою даної технології є повна відсутність у препараті бактеріальних ендотоксинів і пірогенів клітинної стінки. Незважаючи на всі ці переваги одержання інсуліну з використанням бактеріальних штаммів-суперпродуцентів залишається кращим завдяки більше високому рівню експресії інсуліну в складі гібридного білка.

У цей час генно-інженерний інсулін виготовляють шляхом ферментації генетично змінених мікроорганізмів (кишкової палички, дріжджів), які здатні синтезувати попередник інсуліну (проінсулін) у складі химерного протеїну. З отриманого біосинтетичним шляхом проміжного продукту ензиматичним шляхом реконструюють інсулін людини. Виробнича схема процесу наведена в табл. 2 .

Таблиця 2: Принципова схема виробництва ГЕНО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ

№ стадії Технологічний процес

1 Культивування штаму Е. coli з вбудованим геном гібридного білка, що включає повну послідовність інсуліну людини

2 Очищення й ренатурація ГБ

3 Протеолітичне розщеплення ГБ с одержанням інсуліну

4 Очищення інсуліну

Дана схема багато в чому нагадує процес біосинтезу інсуліну в острівцях Лангерганса, де гормон спочатку з'являється у вигляді білка-попередника (проінсулину), а потім протеолітичними ферментами від проінсулину відщеплюється сполучний С-пептид у спеціальних везикулах. У виробництві для розщеплення ГБ використають подібні по специфічності ферменти: трипсин і карбоксипептидазу В. Гідроліз проводять шляхом обробки ферментами послідовно або одночасно.