Виробництво генно-інженерного інсуліну людини. Оптимізація умов ферментативного гідролізу при виробництві
При такій послідовності проведення технологічного процесу порівняно нескладно очистити ДАІ від домішки дезтреонінінсуліну (інсуліну, у якому відсутній треонін у положенні ВЗО), однієї з найбільше важковидаляємих домішок інсуліну.Для збільшення об'єму інсуліну, що випускається, і зменшення собівартості кінцевого продукту на ВАТ «Національні біотехнології» було вирішено розробити й запустити у виробництво схему одержання ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ методом спільного гідролізу.
Даний метод заснований на одержанні первинного інсуліну в одну стадію шляхом одночасного впливу трипсину й карбоксипептидази В на ГБ. При більш високій технологічності основна проблема спільного гідролізу полягає в пошуку оптимальних умов, при яких утвориться мінімальна кількість дезтреонінінсуліну. Визначення кількості цієї домішки в гідролізаті є важким (за одними даним він невіддільний від інсуліну , а за іншимі - від дезамідоінсуліну). Однак завдяки великій економії часу й реактивів метод спільного гідролізу в цей час є найпоширенішим і використовується для виробництва ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ як у Росії (ИБХ РАН), так і за рубежем (Eli Lilly, США, Biobras, Бразилія).
Метою даної роботи був пошук оптимальних фізико-хімічних умов для проведення спільного (одностадійного)гідролізу ГБ.
УМОВИ ЕКСПЕРИМЕНТУ.
У ході експериментів використовували карбоксипептидазу В с активністю 200 од/мг і трипсин з активністю 239 од/мг виробництва ГосНИИгенетика (Росія).
Основним методом визначення кількості й чистоти білків, що утворяться в ході гідролізу, була аналітична ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ, проведена на аналітичному ВЄЖХ-хроматографі «Dionex», США (колонка «Phenomenex», США, 250x4,6 мм, С18, розмір часток 5 мкм). Представлені хроматограми отримані при використанні програмного забезпечення «Chromeleon 6.0».
Продуцентом ГБ був штам Е. coli JM109/pPlNS07, отриманий спільно співробітниками ВАТ «Національні біотехнології» і ІБХ. Ренатурований ГБ надходив на стадію гідролізу в 0,1 М трис-HCl у концентрації 8 ± 2 г/л.
РЕЗУЛЬТАТИ.
Як відомо, спільний гідроліз ГБ протікає у дві стадії: трипсиноліз ГБ до проміжних продуктів (ДАІ й МОНОАРГІНІНІНСУЛІН) і їх карбоксипептидоліз із утворенням інсуліну. Таким чином, трипсиноліз є визначальною, а карбоксипептидоліз - залежною стадією спільного гідролізу. Отже, всі продукти трипсинолізу ГБ будуть продовжувати утворюватися й під час реакції спільного гідролізу.
Серед продуктів трипсинолізу ГБ крім ДАІ й МОНОАРГІНІНІНСУЛІНу у великій кількості містились домішки білоку (до 25% від загального білка), що має час виходу при ВЕРХ-аналізах трохи більше, ніж час виходу інсуліну. Завдяки цій його особливості білок був названий «правим плечем» (ПП) (мал. 2).
Мал. 2. Порівняння ВЕРХ-хроматограм гідролізу в присутності (суцільна лінія) і під час відсутності (пунктир) внутрішнього стандарту інсуліну: I - пік внутрішнього стандарту інсуліну; II - праве плече; III - пік діаргінінінсуліну: IV - пік моноаргінінінсуліну.
Даний білок утворювався й при проведенні спільного гідролізу (мал. 3).
Мал. 3. ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ продуктів спільного (трипсин + карбоксипептидаза) гідролізу ГБ: I - інсулін; II - ПП
Спроби очистити інсулін від даної домішки за допомогою іонообмінної і ВЕРХ-хроматографії призвели до великих втрат через те, що відділення ПП від інсуліну було важко виконати. Таким чином, головним завданням став пошук таких фізико-хімічних умов спільного гідролізу, при яких формується мінімальна кількість ПП.
Підбор оптимальних рН і температури проведення спільного гідролізу ГБ
Була виявлена строга залежність збільшення кількості ПП від підвищення температури (мал. 4).