Виробництво генно-інженерного інсуліну людини. Оптимізація умов ферментативного гідролізу при виробництві

Сучасне виробництво генно-інженерного інсуліну людини в Росії.

В 1996 році в Російській федерації прийнята цільова федеральна програма «Цукровий діабет», що передбачає створення виробничих потужностей по виробництву генно-інженерного інсуліну людини. У рамках цієї роботи вчені з ВАТ «Національні біотехнології» (п. Оболенськ, Московська область) при участі співробітників Інституту біоорганічної хімії (ІБХ) РАН і Державного інституту кровозамінників і медичних препаратів за 4 роки спільної роботи створили штам-продуцент гібридного білка Е. coli JM109/pPINS07 і лабораторну методику одержання ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ. Була проведена перевірка якості отриманого препарату й лікарських форм на його основі й підготовлене технічне завдання на проектування лінії потужністю 5-10 кг субстанції інсуліну в рік.

На основі цих розробок ВАТ «Національні біотехнології» в 2003 р. була введена в експлуатацію дослідно-виробнича лінія по випуску субстанції ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ потужністю 10 кг/рік . Дана лінія відповідає вимогам для генетично-модифікованих продуктів Європейського Союзу й робить ГЕННО-ІНЖЕНЕРНИЙ ІНСУЛІН ЛЮДИНИ, що відповідає всім основним показникам якості у міжнародних фармакопеях. Принциповий технологічний процес виробництва ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ на підприємстві ВАТ «Національні біотехнології» представлений у табл. 3.

Таблиця 3: Технологічна схема виробництва ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ на ВАТ «Національні біотехнології»

№ стадії Технологічний процес

1 Культивування штаму-продуцента Е. coli JM109/pPINS07

2 Руйнування клітин

3 Відділення осаду ГБ-сирцю центрифугуванням

4 Розчинення ГБ з одночасним відновленням нерегулярних S-S-зв'язків

5 Ренатурація ГБ з утворенням правильних S-S-зв'язків

6 Хроматографічне очищення ГБ на іонообмінному сорбенті (КМ-сефароза)

7 Гідроліз ГІБРИДНИЙ БІЛОК трипсином (одержання диаргинининсулина)

8 Хроматографічне очищення діаргінінінсуліну на іонообмінному сорбенті (SP-Sepharose FF)

9 Концентрування фракцій, що містять 90% діаргінінісуліну

10 Трансформація ДАІ карбоксипептидазою В (одержання первинного інсуліну)

11 Очищення первинного інсуліну методом фазової ВИСОКОЕФЕКТИВНОЇ РІДИННОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ до чистоти >96%

12 Хроматографічне очищення ГЕННО-ІНЖЕНЕРНОГО ІНСУЛІНУ ЛЮДИНИ від високо- і низькомолекулярних домішок за допомогою гель-фільтрації

13 Кристалізація й перекристалізація інсуліну в присутності іонів Zn+2

14 Сушіння кристалів Zn-інсуліну

Метод заснований на технології так названого «роздільного гідролізу», при якому ГБ піддається спочатку розщепленню трипсином з одержанням основного продукту - діаргінінісуліну , а потім ДАІ піддається хроматографічному очищенню, концентруванню й трансформації в первинний інсулін із чистотою не менше 92-96%.