Агробактеріальна трансформація ячменю

Використання як факторів, що стимулюють трансформацію, ацетосірінгону та екстракту з рослин тютюну. Деякі культури для проведення успішної трансформації, вимагають особливих умов сокультивування. Так наприклад, для підвищення ефективності трансформації цукрового очерету в суспензію, що містить A. tutnefaciens й експланти, додавали аскорбінову кислоту (0,09 мкМ) і цистеін (0,33 мкМ) [16]. Для успішної агробактеріальної трансформації однодольних рослин звичайно використовують ацетосірінгон [17-19].

Екстракт із рослин тютюну на практиці широко й з успіхом застосовують при проведенні агробактеріальної трансформації самий різних видів рослин й експлантів. Відомо, що механічно ушкоджені й рослинні клітини, що активно діляться, дводольних рослин утворюють речовини, індукуючі vіr-гени [20]. Цілком можливо, що екстракт тютюну є природним джерелом подібних речовин.

При обробці насінь ячменю суспензією A. tumefaciens, що містить ацетосірінгон або екстракт тютюну, нами отримані стійкі до канаміцину

рослини. Зелені регенеранти висаджували в ґрунт. Через 10-15 днів культивування рослини обробляли гербіцидом "Basta" у концентрації 8 мг/л. Рослини, стійкі до гербіциду, мали зелене забарвлення й формували вегетативні органи. У частини з них ПЦР-анализ підтвердив включення в ДНК рослин гена bar (малюнок).

Без використання ацетосірінгону або тютюнового екстракту одержати трансформовані рослини не вдалося (контрольний варіант). Для здійснення трансформації виявилася ефективної штучна активація генів вірулентності бактерій.

Хоча ацетосірінгон й інгібує деякою мірою проростання насінь ячменя, однак частота трансформації рослин ячменя в результаті даного експерименту становить 2%. Цей показник для однодольних рослин відповідає середньому рівню й тому є цілком прийнятним. Слід зазначити, що при використанні екстракту тютюну (без ацетосірінгону) частота трансформації трохи вище (2,7%).

Застосування вакуумної обробки. Застосування вакуумної обробки вперше було здійснено при трансформації Arabidopsis thaliana [21 ]. Цей спосіб активно використовується для одержання трансформованих рослин однодольних інших видів [14, 22]. Для підвищення ефективності трансформації насіння витримували в агробактеріальної суспензії (з додаванням екстракту тютюну) в умовах вакууму (-1 кГс/див ) протягом 1 год. Ціль такої обробки полягала в полегшенні проникнення клітин агробактерій у внутрішні тканини зерновки.Застосування вакуумної інфільтрації дало позитивний ефект. Хоча обробка вакуумом трохи гнітить проростання насінь, однак частота трансформованих рослин досягла 4 %. Для однодольних культур це гарний результат.

Спадкування введеного гена bar. Всі рослини ячменя покоління Т0, які виявилися стійкими до гербіциду "Basta", формували фертильні насіння. Надалі рослини наступного покоління висівали в ґрунт і також обробляли гербіцидом. Стійкими виявилися 80 % рослин. У всіх стійких до гербіциду рослин ячменя при дослідженні препарату геномної ДНК виявлена присутність послідовності гена bar, тобто в 80% представників покоління Т1 відбувалася експресія гена - маркера трансформації. Фінські дослідники при аналізі трансгенних рослин ячменя, отриманих методом балістичної трансформації, показали, що 65% рослин покоління Т1 успадковували експресію гена [23].

Головна особливість пропонованої технології трансформації ячменя - це використання насінь, що проростають, у якості реципієнтної системи, завдяки чому трансформаційна процедура здобуває ряд технологічних переваг.

Перша з них полягає в тому, що необхідні для трансформації тканини містяться в сухих насіннях, у зв'язку із чим відпадає необхідність вирощувати донорну рослину в строго контрольованих умовах або одержувати тканини, компетентні для сокультивування з бактеріями. Клітини такої реципієнтної системи компетентні для трансформації з боку Т-ДНК.

Друга перевага - це збереження насінням після впровадження чужорідної ДНК здатності до енергійного росту (у порівнянні з регенерантами з каллуса) і утворенню То-потомства. При одержанні трансгенних рослин традиційним способом, тобто шляхом регенерації, проростки володіють значно менш енергійним ростом, чим пагони з насінь, через що процес одержання покоління Т0 досить тривалий.

Третьою важливою перевагою пропонованої технології є відсутність етапу регенерації рослини в традиційному розумінні. Фактично цей етап проходить у формі природного для будь-якого насіння росту й розвитку, що закінчується плодоносінням і формуванням покоління Т,.

Таким чином, у пропонованій технології повністю відсутні етапи, пов'язані з необхідністю культивування яких-небудь тканин in vitro, що дозволяє уникнути появи сомаклональної мінливості, що завжди несе із собою небезпеку неконтрольованого відхилення від вихідного генотипу, а також створює можливість для використання даного методу для роботи з іншими генотипами незалежно від морфогенетичного потенціалу їхніх тканин.