Агробактеріальна трансформація ячменю

Після інокуляції насіння переносили на стерильний фільтрувальний папір або тканину для видалення суспензії агробактерій. Потім протягом 7-10 днів їх пророщували у світловій камері на середовищі МС (1/2 концентрації

мінеральних солей, без гормонів) з додаванням 500 мг/л клафорану (Roussel Uclaf, Франція) для інгібування подальшого росту агробактерій й 50 мг/л канаміцину («Ферейн», Росія) як селективний агент. Культивування рослинного матеріалу проводили в наступних умовах: 24-25°; освітленість 5 клк; тривалість світлового дня 16 год.

Зелені проростки ячменя висаджували в ґрунт і вирощували в теплиці при температурі 20° і тривалості світлового дня 14 ч.

Через 10-15 днів рослини обприскували розчином гербіциду "Basta" (8 мг/л). Рослини, стійкі до гербіциду, мали зелене забарвлення й продовжували формувати вегетативні органи.

ПЦР-аналіз. Матеріал, отриманий з рослин, що виявили стійкість до гербіциду, використали для виділення геномної ДНК по методу Moller et al [9], що потім аналізували методом ПЦР.

Для ПЦР використали пару праймерів для гена bar (З AT «Синтол», Москва):

bаr-1 плюс:

5'-TGC-ACC-ATC-GTC-AAC-CAC-TA-3';

bar-2 мінус:

5'-АС A-GCG-ACC-ACG-CTC-TTG-AA-3'.Ампліфікацію проводили в програмувальному термоциклері МС2 (ЗАТ «Днк-технологія», Москва).

Продукти реакції з реакційної суміші (10 мкл) розділяли електрофорезом в 2%-ном агаризованому гелі із бромистим етидієм у ТВЄ-буфері. Для визначення довжини фрагментів використовували маркер МЗ (123 bp DNA Ladder) Gibco BRL, США. Як негативний контроль у реакційну суміш замість досліджуваної ДНК додавали 5 мкл води. Як позитивний контроль використовували плазмідну ДНК зі штаму Agrobacterium tumefaciens 3850/рВАЗ. ПЦР-анализ проводили в трикратній повторності для кожного зразка геномної ДНК зародків ячменя.

РЕЗУЛЬТАТИ і ОБГОВОРЕННЯ

За останні роки був виконаний ряд робіт із трансформації ячменя, у тому числі й агробактеріальним методом [10, 11]. У більшості випадків як реципієнти були використані незрілі зародки сорту Golden Promise або отриманий з них морфогенний каллус. Згодом для одержання трансформованих рослин необхідно було регенерувати рослини з каллуса, що неминуче пов'язане із тривалим культивуванням in vitro, використанням фітогормонів і ризиком прояву сомаклональної мінливості.

Довгий час вважалося, що на процес трансформації істотний вплив робить ушкодження потенційного хазяїна. Всі спроби провести трансформацію однодольних рослин через неушкоджений епідерміс довгий час залишалися безуспішними [12]. В 1987 р. була проведена успішна агробактеріальна трансформація насінь, що проростають, Arabidopsis thaliana [13]. Одним з переваг пропонованого в даній роботі методу є відсутність необхідності використовувати ушкоджені рослини реципієнта. Опис методу, а також вплив на нього ряду фізичних факторів і хімічних агентів наведені в наступних розділах.

Тривалість сокультивування агробактерій і насінь. За результатами наших попередніх досвідів і за літературним даними, оптимальний час трансформації становить не менш доби [14]. Можливо, саме такий час необхідно для проникнення агробактерій крізь клітинну стінку однодольних рослин, якщо цей процес відбувається шляхом ферментативного розчинення клітинної стінки [15]. При меншому часі експозиції поява трансформованих рослин у наших досвідах не спостерігалась. Сокультивування протягом більше 2 діб приводить до різкого збільшення концентрації бактеріальних клітин у суспензії і їхньому згубному впливі на насіння. Так, якщо після 24 ч інкубації насінь у суспензії агробактерій сходять 70 % насінь ячменя, то через 2 діб-55 %, а через 3 діб- 15 % (усереднені показники, отримані в даній роботі).