Результати санітарної селекції клонів сортів винограду
На другому етапі, з 1991 до 1995 рр. тестування проходили, головним чином, клони першого вегетативного покоління. Для перевірки на приховане ураження вірусною інфекцією використовували ІФА (діагностичні набори власного виробництва та з 1995 року — діагностичні набори виробництва фірми „Агрітест” (Італія)) [5, 6]. Як допоміжні методи неспецифічного скринінгу використовували аналіз електрофоретичних профілів дволанцюгової РНК (длРНК) та молекулярну гібридизацію з длРНК-зондами [7, 8].
З 1991 до 1995 рр. було тестовано найбільшу кількість клонів, через технологічні особливості процесів клонової та санітарної селекції на етапі першого вегетативного покоління [2].З 1996 до 2006 рр. перевагу в тестуванні отримують клони другого вегетативного покоління рекомендовані для розмноження, та рослини банку клонів, що зменшило вибірку тестування. Тим самим закінчуються етапи вивчення клонів, які були відібрані в 1981–1990 рр. Головним методом для виявлення вірусів залишається імуноферментний аналіз, хоча для вибіркового контролю санітарного стану клонів використовується аналіз електрофоретичних профілів длРНК та молекулярна гібридизація.
Санітарний стан перспективних клонів щодо вірусної інфекції остаточно визначали на підставі результатів, отриманих кількома різними методами. Це важливо, особливо із урахуванням того, що перелік вірусних хвороб, на які проводилося тестування лабораторними методами, розширювався поступово, із збільшувався доступної методичної бази сертифікованого розсадництва в світі. Так, на перших двох етапах, зазначених в табл. 1, серологічна діагностика проводилася, головним чином, на віруси коротковузля і скручування листя (без визначення серотипу останнього) та обмежено — на вірус мозаїки резухи. Застосування індексації щепленням дозволило певною мірою скорегувати недостатній перелік вірусів у серологічній діагностиці, а також виявити хвороби, які навіть тепер серологічно не виявляються (наприклад, некроз жилок). Неспецифічне виявлення вірусної інфекції за допомогою аналізу длРНК та молекулярної гібридизації з длРНК-зондами також зробило свій внесок у вірогідність результатів оцінки санітарного стану клонів.
З третього етапу перелік вірусів, на які проводиться тестування, розширюється за рахунок використання імпортних діагностикумів. На цьому етапі визначали вірус коротковузля винограду, перший та третій серотипи вірусу скручування листя, а також вірус мармуровості, віруси А і В винограду.
На четвертому етапі визначали сім вірусів винограду (коротковузля, мозаїки резухи, перший, другий та третій серотипи вірусу скручування листя, вірус мармуровості, вірус А винограду).
Отже, кожний етап тестування з технологічної та методичної точки зору характеризується певним комплексом методів, доцільність використання яких визначалася їх чутливістю та специфічністю. При аналізі співвідношення методів, що використовувалися для тестування на віруси протягом 1985–2006 рр., визначено, що найбільший відсоток припадає на імуноферментний аналіз (близько 85 %), значно менший — молекулярно-біологічні методи та біологічна індексація (відповідно 9 і 6 %). Співвідношення між використанням ІФА та молекулярно-біологічних методів загалом відповідає цьому показнику робіт європейських лабораторій, що контролюють санітарний стан садивного матеріалу винограду (згідно даних Міжнародної Ради з вивчення вірусів та вірусних хвороб винограду (ICVG)). Цей факт пояснюється високим рівнем стандартизованості параметрів ІФА та простотою і швидкістю його виконання. Стандартизувати молекулярно-біологічні методи, які відрізняються великою кількістю модифікацій, наразі ще важко.
Фрагмент аналізу результатів тестування клонів за допомогою різних методів, наданий в таблиці 2, демонструє доповнення результатів індексації щепленням і ІФА пізнішими даними аналізу длРНК і молекулярної гібридизації.
Табл. 2. Порівняльний аналіз результатів тестування кущів клонів винограду за допомогою біологічної індексації, імуноферментного аналізу і молекулярно-біологічних методів.
Примітка.
Позначка «+», або позитивний результат тестування, означає наявність ураження вірусами, позначка «-», або негативний результат тестування, означає відсутність ураження вірусами.
З табл. 2 видно, що тільки у випадку тестування кущів клону 1632 сорта Сухолиманський білий отримані результати, які підтверджують ураження його вірусом мармуровості за допомогою усіх використаних методів. Проте санітарний статус цього клону визначається як задовільний, оскільки присутність напівлатентних хвороб на клоновому матеріалі згідно з чинним законодавством Європейської Спілки не перешкоджає його промисловому розмноженню та використанню.