Гельминтози. Лабораторні методи діагностики

Методи лабораторної діагностики гельмінтозів поділяються на дві групи: париитологічні й імунологічні.

Паразитологічні методи

Матеріал для дослідження: фекалії, сеча, дуоденний вміст, мокротиння, кров, шкіра, перианальний детрит, м'язова тканина. Гельмінтокроскопічні методи — методи дослідження фекалій — поділяють на макро- і мікроскопічні.

Макроскопічні методи засновані на виявленні осіб гельмінтів або їхніх фрагментів (члеників, сколексів). Вони використовуються як з діагностичною метою (ентеробіоз, теннідози), так і з метою контролю ефективності дегельмінтизації в процесі її проведення (наприклад, при тенідинозах, дифілоботріозі). Принцип дослідження полягає в тому, що гельмінти і їхні фрагменти добре видні на темному тлі фотографічної кювети (чорного кольору) або пофарбованої чорним лаком тарілці при перегляді розріджених водою фекалій. Дослідження ведеться при гарному освітленні, переглядають суспензію фекалій окремими порціями — фракційним методом. Усі підозрілі включення витягають пінцетом і вивчають на предметних скельцях або між ними за допомогою лупи або малого збільшення мікроскопа. При визначенні дрібних об'єктів — сколексів цестод, карликових цінней — перегляд можна проводити, помістивши їх у краплю 50% водного розчину гліцерину. Диференціація між окремими видами гельмінтів ґрунтується на їх анатомо-морфологічних ознаках. Можна використовувати метод відстоювання: фекалії поміщають у велику судину, заливають десятикратною кількістю води, взбовтують і відстоюють до одержання осаду. Надосадову рідину зливають, осад заливають новою порцією води і так 3—5 разів промивають осад до одержання прозорої надосадової рідини. Осад, що залишився, вивчають фракційно.

Мікроскопічні методи засновані на виявленні яєць і личинок гельмінтів. У залежності від мети дослідження вони поділяються на якісні і кількісні.

Якісні методи. Фекалії, що підлягають дослідженню, повинні бути свіжими, не більш добової давнини. При масових дослідженнях можна використовувати рідини, що консервують: 4—10% розчин формаліну, консервант А. И. Щуренкової (0,2% розчин азотнокислого натру — 1900 мл, розчин Люголя — 250 мл, формалін — 300 мл, гліцерин — 25 мл) та ін. Консерванти в рівному обсязі додають до проби фекалій. Якісні методи поділяються на нативні і методи збагачення.

Нативні методи. Метод товстого мазка по Като. Принцип методу полягає в тому, що яйця гельмінтів знаходяться в товстому мазку фекалій, прояснених гліцерином і підфарбованих малахітовою зеленню.

Реактиви, необхідні для дослідження: 1) 3% водний розчин малахітової зелені; 2) гліцерин; 3) 6% водний розчин фенолу; 4) суміш Като: 6 мл 3% водного розчину малахітової зелені, 500 мл гліцерину, 500 мл 6% розчину фенолу (вона може довгостроково зберігатися при кімнатній температурі в закритому посуді); 5) целофанові покривні плівки Като: гідрофільний целофан, розрізаний на шматочки розміром 20×40 мм і витриманий у суміші Като 24 год. Їх можна зберігати в розчині Като, у добре закритому посуді при кімнатній температурі.

Шматочки фекалій величиною з горошину наносять на предметне скло, накривають целофановою плівкою і придавлюють гумовою пробкою (№ 5) для рівномірного розподілу матеріалу. Мазок залишають при кімнатній температурі для просвітління і мікроскопують через 1 год, улітку через 30—40 хв. Метод найбільш ефективний при аскаридозі, трихоцефалезі, дифіллоботріозі, теніїдозах і в меншому ступені — при анкилостомітодах і карликовому гіменолепідозі.

Метод закручування (по Е. С. Шульману, 1933). Цей простий метод дозволяє виявити не тільки яйця гельмінтів, але і личинки кишкової угриці, у цьому його безсумнівна перевага.

2-3 г фекалій розмішують скляною паличкою при поступовому додаванні двох-чотирикратного об’єму води, потім енергійними круговими рухами «закручують» суспензію фекалій протягом 1-2 хв. При цьому яйця і личинки захоплюються до центра обертання і при швидкому витягу палички накопичуються в краплі рідини на її кінці. Краплю переносять на предметне скло, накривають покривним склом і мікроскопіюють.

Методи збагачення. Метод Кофоїда — Варбера в модифікацї Фюллеборна, заснований на принципі спливання яєць у насиченому розчині повареної солі.

400 г повареної солі розчиняють при кип'ятінні в 1 л води, фільтрують через шар марлі, питома вага розчину —1,18.5-10 г фекалій розмішують дерев'яною або скляною паличкою з двадцятикратною кількістю насиченого розчину повареної солі в порцеляновому або скляному стаканчику обсягом 100—200 мл. Відразу ж по закінченні розмішування совочком з папера або картону знімають вспливші на поверхню неростерті частки і залишають суміш. Після закінчення 40 хвилин - 1,5 год дротяною петлею (діаметром 0,8—1 см) знімають поверхневу плівку 6—8 разів, повторно торкаючись поверхні рідини. Після зняття плівки обов'язково досліджують осад (2 препарати), забираючи його скляною піпеткою або цією же петлею після зливу надосадочної рідини. У плівці виявляють яйця власоглавів, анкілостомід, трихостронгилід, запліднені яйця аскарид, карликових ценней, частково онкосфери теніїд. Яйця трематод, широкого лентеца, онкосфери, теніїд, незапліднені яйця аскарид виявляють в осаді.

Можна зняти всю плівку широким предметним склом, накривши ним банкову, заповнену розчином до утворення опуклого меніска (В.А. Гефтер, 1964). Після відстоювання предметне скло швидко перевертають і мікроскопіюють.

Можна на відстояну рідину нанести 1—2 краплі мильно-спиртової суміші (зелене мило і спирт беруть напополам), що, розтікаючись по поверхні, стискає плівку і її легко зняти петлею за 2—3 рази.

Метод Калантраян. Принцип методу той же, що і попереднього. У якості флотаційного розчину використовують насичений розчин азотнокислої селітри NaNO3). Для приготування розчину один об’єм селітри розчиняють у рівному об’ємі води при кип'ятінні до утворення плівки, питома вага розчину - 1,38-1,4. Методика проведення дослідження така ж, як при розробці по Фюллеборну, але тому що в цьому розчині яйця всіх гельмінтів спливають у плівку, то досліджують тільки плівку, знімаючи її через 20 хв після розмішування фекалій.

Можна використовувати флотаційний розчин по А. Н. Брудастову і Л.Н. Красноносу (1969). Для його виготовлення 900 г азотнокислого натрію і 400 г азотнокислого калію розчиняють при підігріванні в 1 л води. Питома вага розчину - 1,47-1,48.

Метод Красильникова з застосуванням детергентів типу «Лотос», «Экстра» і ін.

Принцип методу полягає в тому, що під дією поверхово активних речовин, що входять до складу детергентів, яйця гельмінтів звільняються від фекалій і концентруються в осаді.

Застосовують 1% розчин прального порошку «Лотос». Попередньо порошок висушують у сушильній шафі при 100 0С протягом 1-2 год; 10 г його розчиняють у 1 л водопровідної води. При відсутності «Лотоса» можна користуватися іншими пральними порошками, але для кожного з них потрібно підібрати відповідну концентрацію розчину: для його готування беруть таке максимальне навішення прального порошку, що розчиняється без утворення осаду.

Фекалії для дослідження бажано поміщати в розчин детергентів не більш ніж через 1 год після дефекації.

I спосіб. Фекалії (завбільшки лісовий горіх) поміщають у розчин детергенту в співвідношенні 1:20 (20-30 мл розчину). Відстоюють не менше доби. На дні склянки утвориться двох-тришаровий осад: нижній шар складається з грубих часток, у середньому шарі концентруються яйця гельмінтів, у верхньому — легкі хлоп’я. Пастеровською піпеткою з високо відбитим кінцем набирають 1—3 краплі осаду із середнього шару і наносять на предметне скло. Краплі накривають покривними стеклами або целофановою плівкою по Като і мікроскопіюють.

II спосіб. Фекалії змішують з розчином детергенту в співвідношенні 1:10 до утворення суспензії. Через 30 хв вміст пробірки струшують протягом 1—2 хв, після чого центрифугують 5 хв при 1000—1500 об/хв. З осаду готують 2 препарати на склі.

Спеціальні методи дослідження на фасціолез. Метод послідовних зливів. Фекалії розмішують з водою (1:20), рідину фільтрують через марлю, відстоюють 5 хв. Зливають надосадовий шари, до осаду додають нову порцію води, збовтують і фільтрують у конічні склянки. Послідовні промивання з п'ятихвилинним відстоюванням повторюють 4—5 разів. Отриманий осад мікроскопіюють.

Флотационно-седиментационный метод Демидова. 3—5 м фекалій поміщають у склянку і розмішують з насиченим розчином повареної солі, відстоюють 15—20 хв, паперовим совочком видаляють, що спливли на поверхню частки. Надосадову рідину видаляють, до осаду доливають воду і, збовтавши його, фільтрують через марлю або сито в склянку. Фільтрат відстоюють 5 хв, потім видаляють надосадову рідину, залишивши на дні 15—20 мол осаду. Переливають його в конічну склянку, відстоюють 5 хв, відсмоктують рідина і повторюють процедуру. Відмитий осад наносять на предметне скло і мікроскопіюють.

Спеціальний метод дослідження на стронгілоідоз. Метод В е р м а н а. Метод заснований на тропізмі личинок до тепла. Для розробки фекалій потрібна лійка, гумова трубка з затиском і металевою сіточкою.На кінець лійки надягають гумову трубку з затиском; на основі лійки поміщають металеву сітку, на якій знаходиться 5-10 г фекалій. Лійку наповняють теплою водою (45°С) так, щоб фекалії, що лежать на сітці стикалися з нею. Личинки з фекалій активно переходять у теплу воду й осідають над затиском у нижній частині гумової трубки. Через 2—3 год,

відкривши затиск, спускають осад у центрифужну пробірку, центрифугують 2—3 хв, надосадову рідину швидко зливають, а осад мікроскопіюють на предметному склі.

Спеціальний метод дослідження на анкілостоматози. Метод Харада і Мори (культивування личинок анкилостомид на фільтрувальному папері). Принцип методу полягає в тому, що у вологому середовищі при сприятливій температурі з яєць анкілостомід утворяться личинки, які легко знайти за допомогою лупи. Можна провести диференціальну діагностику двох видів личинок — анкілостом і некаторов. Досліджувані фекалії повинні бути узяті не пізніше ніж через 1 год після дефекації. На смужку фільтрувального паперу розміром 13×1,5 см наносять 0,5 г фекалій так, щоб її кінці залишилися вільними. Паперова смужка опускається в пробірку, на чверть заповнену водою. Один кінець смужки занурений у воду, інший виступає з пробірки й утримується пробкою. Пробірку поміщають у термостат при температурі 26 °С. Утворені з яєць личинки опускаються по смужці фільтрувального паперу й осідають на дні пробірки. Через 5—6 днів папір витягають і знищують, а рідину досліджують під лупою або досліджують під мікроскопом осад, отриманий при центрифугуванні рідини. Спеціальні методи дослідження на ентеробіоз і тенаринхоз. Перианальний і перианально-ректальный заскрібок. Зіскрібки роблять або ранком (до акту дефекації і туалету перианальной області), або ввечері (через 30 хвилин, 1 год, після того, як хворий ліг спати). На предметне скло наносять краплю рідини: фізіологічний розчин або кип'ячену воду, 1% розчин соди, 50% водний розчин гліцерину. Сірником, відточеним у виді лопаточки і змоченим в рідині, обережно роблять зіскрібок з поверхні перианальних складок по радіусі до центру. Отриманий детрит зскрібають зі шпателя покривним склом у краплю рідини і, накривши препарат цим же склом, мікроскопіюють. Замість дерев'яного шпателя можна використовувати ватяний тампон на сірнику, краще обгорнутий тонкою капроновою тканиною. Злегка зволоженим тампоном ретельно змивають перианальну область, а потім вносять його в центрифужну пробірку з кип'яченою водою або фізіологічним розчином (2 мл), прополіскують, рідину центрифугують і мікроскопіюють осад. Целофановий метод Холу. Квадратний шматочок целофану зміцнюють на кінці скляної палички за допомогою гумового кільця. Отриманим сухим целофановим тампоном роблять зіскрібок і кладуть його в пробірку. У лабораторії кінчик целофану підрізають ножицями або бритвою, розправляють на предметному склі, змочують децинормальним розчином їдкого натру, накривають покривним склом і мікроскопіюють.

Метод Грехема. До перианальних складок обстежуваного притискають смужку целюлозної стрічки клейкою стороною вниз, потім її поміщають на предметне скло і мікроскопіюють.

Спеціальні методи дослідження фекалій на шистоматози.

Метод осадження. Порцію фекалій змішують з 250 мл води, проціджують через 3 шари марлі в конічну посудину, щодоверху наповняють водою. Через 30 хв шар рідини зливають, до осаду доливають свіжу порцію води. Осад промивають до одержання прозорої надосадової рідини і мікроскопіюють.

Метод лярвоскопії. Використовують колбу Эрленмейера з напаяною збоку скляною трубочкою, спрямованою нагору. У неї поміщають 20—25 г фекалій і промивають водопровідною водою. Потім колбу накривають темним папером, залишивши на світлі напаяну скляну трубочку при температурі 25—30 °С. Вилупившіся мірацидії концентруються біля меніска в бічній трубочці, де їх можна побачити за допомогою лупи або неозброєним оком.

Методи дослідження сечі на яйця шистосом. Досліджувати бажано свіжовипущену мочу, зібрану в період між 10 год ранку і 14 год дня, або добову порцію. Близько 100 мл відстояної сечі центрифугують при 1500 об/хв, отриманий осад наносять на предметне скло і мікроскопіюють.

ВОЗ рекомендує метод фільтрування всієї порції сечі. Після фільтрування фільтри обробляють формаліном або підігрівають (щоб убити яйця), а потім зволожують водним розчином нінгідрину. У підсушених препаратах зародки яєць набувають фіолетове забарвлення.

Гарні результати дає метод лярвоскопії, коли осад сечі обробляється в колбі Ерленмейера (Див. Дослідження фекалій на яйця шистосом).Кількісні методи. Метод Стояла. У мірний циліндр чи в скляну колбочку, заздалегідь відградуйовану на 56 і 60 мл, наливають децинормальний розчин їдкого лугу NaOH (приблизно 0,4% розчину) до мітки 56. Потім додають фекалії доти, поки рівень рідини не досягає 60 мл, тобто 4 мл фекалій. Колбу струшують протягом 1 хв, поклавши в неї скляне намисто для кращого розмішування. Відразу ж, не давши суспензії відстоятися, градуйованою трубочкою або піпеткою набирають 0,15 мл фекальної емульсії (тобто 0,01 г фекалій), наносять на предметні стекла, накривають покривними і мікроскопіюють, яйця лічать. Суму множать на 100, у результаті одержують число яєць у 1 г фекалій. Для більш точного результату підраховують яйця в 2—9 препаратах і беруть середнє число.

Імунулогічні методи

Для діагностики гельмінтозів застосовуються серологічні й алергійні реакції, що можуть бути корисні в клінічній і епідеміологічній практиці тоді, коли інші методи гельмінтологічних досліджень виявляються неефективними. Використуються вони для діагностики гельмінтозів з тканинною локалізацією або міграційним циклом розвитку збуджувача.

У даний час наказом МЗ СРСР № 960 «Про уніфікацію клінічних лабораторних методів дослідження» від 15 жовтня 1974 р. затверджений ряд методів імунодіагностики гельмінтозів і докладно викладена методика їхньої постановки. Для проведення імунологічні реакції, що рекомендується, готуються стандартні діагностикуми, що дає можливість застосовувати їх у будь-якій клінічній і бактеріологічній лабораторії.

Реакція латекс-аглютинації з ехінококовим діагностикумом. Сироватка крові хворого ехінококозом або альвеококкозом зі специфічними антитілами аглітинує частки полістирольного латексу, сенсибілізовані ехінококовим антигеном.

Реагенти. 1. Ехінококовий діагностикум для реакції латекс-аглютинації являє собою ехінококовий антиген (рідина з ехінококових міхурів людини або овець), адсорбований на полістерольному латексі, зваженому в боратно-сольовому буфері (рН 8,2). 2. Боратно-сольовий буфер (рН 8,2). Змішують 50 мл 0,1 М розчину борної кислоти (6,18 г кристалічної борної кислоти розчиняють у 1000 мл дистильованої води), 5,9 мл 0,1 н розчину їдкого натру і доводять до 100 мл дистильованою водою. На кожні 100 мл готової суміші додають по 0,85 г хлористого натрію. Зберігають у холодильнику не більш тижня, перед уживанням профільтровують і перевіряють рН. 3. Кров беруть з вени в кількості 5—6 мл і звичайним способом одержують з неї сироватку, яку можна зберігати в запаяних ампулах при 4-8 °С протягом 2 тижнів, а в замороженому стані — до 2 місяців.

Для кожної досліджуваної і контрольної сироватки в штатив установлюють по 5 пробірок і одну пробірку на всю серію для холостої проби (контроль на реактиви). Досліджувані і контрольні сироватки розводять боратно-сольвим буфером (рН 8,2) у послідовних подвійних розведеннях від 1:4 до 1:64. Обсяг сироваток - 0,5 мл. До кожного розведення сироватки додають по 0,5 мл ехінококового діагностикума, ретельно струшують кожну пробірку і поміщають спочатку на 3 год у термостат при 37 °С, а потім на ніч у холодильник при 4-8°С. Наступного дня пробірки центрифугують 5 хв при 2000 об/хв, переглядають під лупою зі збільшенням у 2—3 рази і по кількості осаду і кольору надосадової рідини оцінюють отримані результати.

Для контролю проводять: 1) реакції з використанням 0,5 мл боратно-сольового буфера і 0,5 мл ехінококового діагностикума; 2) із застосуванням нормальної сироватки; 3) з використанням нормальної гіперімунної сироватки кролика (обидві сироватки прикладаються до комплекту ехінококового діагностикума). Розводять їх так само, як і досліджувану сироватку.

Показники реакції достовірні при негативному результаті реакцій контролю 1 і 2 (холоста проба і реакція з контрольною нормальною сироваткою). У контролі (реакція з гіперімунною сироваткою) повинний бути ясно виражений флоккулят у титрі не менш ніж 1:32.

Якщо цілком випадає сенсибілізований латекс у виді осаду, що складається з великих флокул, і прозорої надосадової рідини реакція оцінюється як різко позитивна. При позитивній реакції надосадова рідина злегка мутнувата, осад складається з дрібних флоккул. Негативна реакція характеризується рівномірно мутною рідиною, відсутністю осаду. Діагностичний титр реакції —1:8.

Можлива неспецифічна аглютинація в перших 2—3 розведеннях у 3—6% випадків досліджуваних сироваток, що може мати місце при цирозах печінки або новотворах.

У випадках ехінококозу аглютинація може бути відсутньою при неплодоносних кистах, а також при обізвествлінні і загибелі ехінококової кисти. Спостерігається це в середньому в 10-15% заражених цією інвазією. Після радикальної операції титри реакції знижуються і через 1—3 г. реакція може стати негативною. Збереження високих титрів або їхнє підвищення свідчить про рецидив захворювання.

Таблиця 5. Схема титрування комплементу в присутності антигену

Таблиця 6. Схема постановки реакції зв'язування комплементу на холодіРеакція зв'язування комплементу на холоді при трихінельозі.

Комплекс антиген — антитіло, що утвориться при наявності в крові хворого антитрихинелізних антитіл, зв'язує комплемент. Комплемент, що залишився в розчині, відтитровують гемолітичним методом. Ступінь гемолізу сенсибілізованих еритроцитів прямо пропорційна кількості комплементу і служить індикатором наявності або відсутності в досліджуваній сироватці антитрінелізних антитіл.

Реагенти. 1. Веронал-мединаловый буфер. Його склад: 85 г хлористого натрію, 5,75 г вероналу, 3,75 г мединалу, 0,22 г СаСl2-2Н2О, 1 г МgСl2-6Н2О (рН буфера 7,3—7,5). Приготування буфера: 5,75 вероналу розчиняють у 500 мл гарячої дистильованої води, прохолоджують, додають інші компоненти і доводять об’єм дистильованою водою до 2000 мл. Зберігають у холодильнику. У день досліду готують робочий розчин буферної суміші розведенням її в 5 разів дистильованою водою. Робочий розчин буферної суміші використовують для розведення всіх інгредієнтів реакції і постановки досвіду. Зазначений буфер можна замінити сольовим розчином хлористого натрію (8,5 г), сірчанокислого магнію (0,1 г), розведених дистильованою водою до 1 л. Збереженню не підлягає. 2. Трихінелізний антиген виробництва Білоруського науково-дослідного інституту епідеміології і мікробіології. У реакції використовують розведення його 1:1000. 3. Комплемент. Застосовують ліофазований комплемент морської свинки. 4. Гемолітична сироватка — інактирована сироватка кролика, імунізованого еритроцитами барана, виробництва Московського науково-дослідного інституту вакцин і сироваток ім. Мечникова. Для досвіду беруть сироватку в потрійному титрі. 5. Еритроцити барана. Дефібровану кров барана центрифугують. Отриманий осад еритроцитів промивають 5—10 об’ємами буферної суміші 3—4 рази шляхом центрифугувания. Потім із щільного осаду еритроцитів готують 3% суспензію в буферному розчині. 6. Гемологічна система. До 3% суспензії баранячих еритроцитів доливають при постійному помішуванні рівний обсяг гемолітичної сироватки, розведеної по потроєному титрі. Суміш поміщають у термостат при 37°С на 30 хв.

Комплемент титрують перед кожною постановкою досвіду. Вихідне розведення — 1:20. Кожне титрування комплементу проводять у присутності антигену, узятого в робочому розведенні. Титром вважається найменша його кількість, що дає повний гемоліз. Робоча доза в реакції на холоді дорівнює подвійному титрові.

Досліджувану сироватку інактивують при 56 °С в протягом 30 хв на водяній лазні. Розливають у пробірки в різних роз веденнях і додають антиген у вихідному розведенні. Діагностичним титром реакції вважають максимальне розведення сироватки з затримкою гемолізу на чотири або три плюси. Реакцію з затримкою гемолізу на 2+ вважають слабододатньою, на 1+ або на ± — негативній.

Реакція зв'язування комплементу на холоді при цистицеркозе.

Реагенти 1. Досліджувана інактивована сироватка. 2. Цистицерковий антиген виробництва Білоруського науково-дослідного інституту епідеміології і мікробіології. 3. Ліофазований комплемент морської свинки. 4. Гемолітична сироватка — інактирована сироватка кролика, імунізованого еритроцитами барана, виробництва Московського науково-дослідного інституту вакцин і сироваток ім. Мечникова. 5. Еритроцити барана. 6. Веронал-мединаловий буфер.

Принцип, методика постановки реакції й оцінка отриманих результатів такі ж, як і при визначенні титру трихінелізних антитіл (описано вище).

Алергійні реакції принципово можуть бути використані при багатьох гельмінтозах. Описано їхнє застосування при шистоматозах і філяритозах. Найбільше добре алергійні реакції вивчені при ехінококозі. Внутрішкірна алергійна проба Каццони дає при цьому захворюванні позитивні реакції в 92% випадків. Алерген, приготовлений з рідини ехінококових міхурів великої рогатої худоби або баранів (користуватися можна тільки виробничими серіями препарату), вводять внутрішкірно туберкуліновим шприцом у дозі 0,1 мл в області передпліччя. Для контролю на іншій руці також уводять фізіологічний розчин. Облік реакції починається відразу після введення алергену. При позитивній реакції в місці введення утвориться папула, що незабаром, збільшуючись у розмірах, перетворюється в міхур білуватого кольору, навколо якого з'являється червоність. Найбільшого розвитку реакція досягає через півгодини і зберігається до 1—2 год. Іноді спостерігаються пізні реакції — через 5—7 год, а нерідко через 24 год на місці введення алергену з'являється запалення. Крім місцевої алергійної реакції, може спостерігатися і загальна, що виражається збільшенням числа еозинофілів у крові, що звичайно відзначається через 24 год після введення алергену.

При введенні алергену у випадках ехінококозу легкого іноді спостерігаються важкі загальні реакції і бурхливі місцеві з проривом міхура і анафілактичним шоком. Тому варто для діагностики ехінококозу й альвеококозу використовувати серологічні методи діагностики, зокрема реакцію латекс-аглютинації.