Молекулярно-генетичні аспекти трансплантації гемопоетичних клітин

Останні роки ознаменовані значним прогресом у вивченні основ трансформації злоякісної клітини. Стало відомо, що субстратом цього процесу є накопичення пошкоджень у генах, які відповідають за регуляцію клітинної проліферації та апоптозу. Це дозволило розробити принципово нові підходи до діагностики, моніторингу і лікування онкогематологічної патології. Молекулярно-генетична діагностика відкрила нові перспективи у розшифровці молекулярних механізмів канцерогенезу, виборі адекватного лікування та підвищенні ефективності терапії. Успіхи в цьому напрямку дозволили ідентифікувати певні молекулярно-генетичні аномалії не тільки в гострий період захворювання, але і виявляти залишковий пул пухлинних клітин у стадії клінічної ремісії. Дані щодо наявності пухлинного клону сприяють визначенню ступеня злоякісності і стадії розвитку пухлинного процесу, що значною мірою визначає вибір тактики лікування. Не можна не відмітити значення імуногенетичного паспорта хворих не тільки в аспекті селекції гістосумісних пар донор–реципієнт, але і при вивченні генетичної схильності до соматичної патології та імунологічних порушень — супутніх проявів при лікуванні. Вивчення асоціації характеристик системи HLA з виникненням, перебігом та прогнозом перебігу захворювання у хворих на онкогематологічну патологію є вкрай актуальним.

Метою даного дослідження було проведення паралелей між клінічним перебігом онкогематологічної патології, з одного боку, та цитогенетичними, молекулярно-генетичними маркерами пухлинного процесу й імуногенетичним профілем — з іншого, для подальшої оптимізації лікувальної тактики і прогнозування перебігу захворювання.

Матеріали та методи

Об’єктом дослідження були 94 хворих на онкогематологічну патологію (хвороба Ходжкіна, неходжкінські злоякісні лімфоми, гострі лейкемії, мієломна хвороба, хронічна лімфоїдна лейкемія (ХЛЛ), хронічна мієлоїдна лейкемія (ХМЛ).У схему обстеження цих пацієнтів — потенційних реципієнтів аутологічної трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин (ТГСК) — для додаткової характеристики особливостей захворювання були введені цитогенетичні, молекулярно-генетичні та імуногенетичні дослідження. Після проведення всебічного первинного обстеження хворих проводилася терапія за розробленими нами протоколами лікування, у тому числі із застосуванням ТГСК. Цитогенетичні дослідження проводилися на прямих та 24-годинних нестимульованих культурах клітин кісткового мозку за стандартною методикою [1]. Ідентифікацію кожної пари хромосом та їх змін проводили згідно з критеріями ISCN (1995) [2]. У контрольну групу ввійшли 59 практично здорових осіб без гематологічної патології.

Результати та їх обговорення

Цитогенетичне дослідження (каріотипування клітин кісткового мозку) проводилося у 21 хворого, у яких було діагностовано: 7 хворих — ХМЛ, 1 — ХЛЛ, 5 — гостра мієлобластна лейкемія (ГМЛ), 5 — гостра лімфобластна лейкемія (ГЛЛ), 2 — хвороба Ходжкіна та 1 —лімфома. Серед пацієнтів з ХМЛ було виявлено пухлинний клон з транслокацією у всіх досліджених метафазах. При цьому в одного з цих пацієнтів у 10 % метафазних пластинок була відсутня Y-хромосома. Клінічними особливостями перебігу ХМЛ даного пацієнта (хворий Х., 23 роки) були гіпертромбоцитоз та 4 % бластів у кістковому мозку на момент встановлення діагнозу. Таким чином, хворий належав до групи високого ризику ХМЛ, у зв’язку з чим була розпочата терапія інтерферонами в поєднанні з цитозаром.

Із п’яти обстежених пацієнтів з ГМЛ у двох був нормальний каріотип; у одного пацієнта (хворий М., 49 років) 81 % клітин представляв клон з додатковою 6-ою та 10-ою хромосомами, а 19 % клітин мали нормальний каріотип. Захворювання характеризувалося несприятливим перебігом — перша ремісія утримувалася 1,5 місяці, після чого розвинувся ранній кістковомозковий рецидив захворювання. П’ять обстежених хворих з ГЛЛ та двоє хворих з лімфогранулематозом (ЛГМ) мали каріотип без порушень.Молекулярно-генетичне дослідження виявило у всіх хворих з ХМЛ (7 осіб) експресію химерного гена BCR/ABL. У більшості пацієнтів (4 з 7) виявлений транскрипт типу b3a2, а у 3 випадках з 7 — b2a2. У двох хворих одночасно було виявлено два різних транскрипти, характерні для ХМЛ, один з яких експресує білок р210, а інший — р190.Серед хворих з ГМЛ (5 осіб) та ГЛЛ (5 осіб), у яких досліджували експресію ряду химерних генів, тільки у одного пацієнта з вторинним ГМЛ виявлений химерний транскрипт MLL/AF9, який формується внаслідок транслокації t(9;11). Вторинна ГМЛ розвинулась у пацієнта через 4 роки після лікування ЛГМ 2А ступеня. Хворий був обстежений на стадії клініко-гематологічної ремісії після проведення індукційних курсів поліхіміотерапії з приводу ГМЛ. Цікаво зазначити, що цитогенетично у нього не було виявлено ніяких хромосомних перебудов. Є дані про те, що порушення, що стосуються сегмента 11q23, є характерною ознакою вторинних лейкемій, розвиток яких пов’язаний з попереднім лікуванням токсичними препаратами (інгібітори ДНК-топоізомерази II та епіподофілотоксин) [3]. Хоча результати деяких досліджень свідчать про те, що пацієнти з ГМЛ de novo та транслокацією t(9;11) відрізняються вищим рівнем виживання, ніж пацієнти з іншими порушеннями в сегменті 11q23, прогноз для хворих з вторинними ГМЛ з порушенням в 11q23 залишається однаково несприятливим [5]. Враховуючи отримані результати, пацієнту було призначено проведення алогенної трансплантації периферичних стовбурових гемопоетичних клітин.У пацієнтів з ХМЛ моніторинг цитогенетичної і молекулярної відповіді на терапію, що проводилася, здійснювався з інтервалом 4–8 місяців. У одного пацієнта відмічена цитогенетична редукція клону з транслокацією t(9;22) на 20 % через 7 місяців після початку лікування препаратами з групи інтерферонів. Однак ще через 8 місяців на фоні терапії спостерігалася тенденція до повторної активації процесу (клон складав 91 %). Слід зазначити, що за даними клініко-морфологічного обстеження відомостей щодо прогресування захворювання не отримано. Продовжується подальший моніторинг пацієнта на фоні лікування.

У іншого пацієнта з ХМЛ (пацієнт Х.), у якого був виявлений складний каріотип, повторне обстеження через 4 місяці після початку лікування не виявило динаміки в елімінації клону. На фоні терапії інтерферонами в поєднанні з цитозаром через 3 місяці у хворого зареєстровано прогресування захворювання з переходом у фазу акселерації. Ситуація була розцінена як рефрактерність до терапії першої лінії, здійснена зміна терапії на глівек у стандартних дозах як найбільш ефективний на сьогодні метод терапії ХМЛ. Відмічена коротка відповідь на лікування протягом двох місяців з подальшим прогресуванням захворювання, трансформацією у бластний криз, рефрактерністю до терапії. Хоча каріотип з втратою Y-хромосоми не розглядають як прогностично несприятливий, у наших спостереженнях пацієнт саме з такими цитогенетичними змінами мав найтяжчий та дуже швидкий перебіг захворювання.

Всі хворі залишалися ПЛР-позитивними протягом всього періоду спостереження. За даними деяких авторів, далеко не всі пацієнти з ХМЛ досягають молекулярної ремісії. Тривалість спостереження за нашими пацієнтами складала від 5 до 15 місяців, що є досить коротким терміном для очікуваної молекулярної відповіді. Навіть після ТКМ у хворих на ХМЛ елімінація пухлинного клону протікає поступово, іноді більше року.

Пацієнту з ГМЛ з гіпердиплоїдним каріотипом цитогенетичне обстеження проводилось як у гострому періоді, так і в стадії клініко-гематологічної ремісії. При цьому не було відмічено будь-яких змін у відсотковому співвідношенні між клітинами з нормальним і патологічним каріотипом. Розпочата терапія на основі високих доз цитозару для рефрактерних форм ГМЛ не мала бажаного ефекту, досягти ремісії не вдалося. Клінічними особливостями даного випадку були перманентна гіперкоагуляція та гіпертромбоцитоз. На теперішній час у пацієнта наступив рецидив.

Результати проведеної роботи свідчать про можливість та доцільність використання цитогенетичних і молекулярно-генетичних методів для визначення генетичних маркерів при різних варіантах гемобластозів, а також подальшого моніторингу мінімальної резидуальної хвороби (МРХ).За нашими даними та результатами інших авторів, в окремих випадках можливим є розходження результатів виявлення химерних генів і відповідних їм хромосомних аберацій [5]. Застосування молекулярно-генетичних методів дозволило виявити криптичні транслокації, що не виявляються цитогенетичними методами, а також транскрипти, що відрізняються тільки на молекулярному рівні і визначаються локалізацією ділянок розривів у генах, що беруть участь у даній перебудові. Цитогенетично їм відповідає одна транслокація. В цьому плані молекулярні методи є більш інформативними в порівнянні з цитогенетичними та FISH-методами.Враховуючи велику кількість хворих на множинну мієлому та лімфогранулематоз, яким на сьогоднішній день не проводиться дослідження мінімальної резидуальної хвороби, перспективним є розвиток методів дослідження реаранжировок гена важких ланцюгів імуноглобулінів як маркера клональності при лімфопроліферативних захворюваннях.

Проведено аналіз перебігу захворювання залежно від HLA-генотипу у хворих на мієломну хворобу (МХ). Встановлено, що в групі хворих на МХ підвищена частота поширеності у генотипі алелей HLA-В* 07 (у 6 з 16 осіб), HLA-А*24 (у 5 з 16 осіб) та HLA-DQA1* 01 (у 10 з 16 осіб). Виявлені певні особливості при аналізі клінічного перебігу захворювання та відповіді на заплановану терапію в даній групі хворих. Наявність гаплотипу HLA-А*24, В*07 у генотипі хворих була пов’язана з несприятливим клінічним перебігом. Так, у цих пацієнтів відмічалася відсутність відповіді на циторедуктивну терапію другої лінії, у одного хворого, якому була проведена трансплантація, через 4 місяці розвинувся ранній рецидив захворювання. Можливо, у даному випадку має велике значення висока асоційованість даних алелей з низькою імунологічною реактивністю організму.

Несприятливим чинником також можна вважати гомозиготність за зазначеними алелями. Наявність у генотипі гомозиготності за групами генів у локусах HLA-В*, DRB1* та DQA1* може бути передумовою розвитку толерантності до специфічної терапії.

Виходячи з результатів проведених генетичних досліджень, у хворих на гемобластози для виявлення генетичних маркерів пухлинних клонів доцільним є використання спектра імуногенетичних, цитогенетичних і молекулярно-генетичних методів. При цьому перевага надається молекулярним методам, враховуючи їх високу роздільну здатність. Генетичні особливості гемобластозів дозволяють визначити прогноз захворювання та тактику лікування. Рання ідентифікація маркерів несприятливого прогнозу обумовлює необхідність застосування більш агресивних схем поліхіміотерапії.

Детекція МРХ на різних етапах терапії має прогностичну цінність, якщо проводити обстеження кожні 3 місяці протягом першого року спостереження, а потім — кожні півроку. Важливим є також кількісне дослідження динаміки пухлинного клону.

Висновки

Отже, позитивний досвід, здобутий у цьому напрямку, є передумовою для пошуку нових шляхів підвищення ефективності лікування хворих на онкогематологічну патологію, у тому числі із застосуванням методу трансплантації ГСК.

На нашу думку, вивчення клінічних ознак хвороби у поєднанні з цитогенетичними та молекулярно-генетичними маркерами пухлинних клонів, а також імуногенетичного профілю хворих на етапах терапії обумовлює оптимізацію формування лікувальної тактики.

Розробки у цьому напрямку мають важливе значення для прогнозування віддалених результатів лікування та вдосконалення профілактичних заходів з урахуванням індивідуальних особливостей хворого.

Література

[1] Кулешова Н. П. Современные методы в клинической цитогенетике// В кн.: Современные проблемы в клинической цитогенетике. Сборник научных трудов/ Под ред. Н. П. Кулешова. – М.: Наука, 1991. – С. 91–146.

[2] Mitelman F. An international system for human cytogenetic, nomenclature 1995. – M.: Karger, 1995.

[3] Rowley J. D. The critical role of chromosome translocations in human leukaemia// Ann.Rev.Genet. – 1998. – Vol. 32. – P. 495–519.

[4] Rowley J. D. The role of chromosome translocations in leukаemogenesis// Seminars in Haematology. – 1999. – Vol. 36, № 4 (Suppl. 1). – P. 59–72.

[5] Ruiz-Arguelles G. L., Garces-Eisele J., Reyes-Nunez V. et al. Assessment of residual disease in acute leukaemia by means of polymerase chain reaction// Rev.Invest.Clin. – 2000. – Vol. 52, № 2. –P. 118–124